Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung)

Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak  sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi  16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

Luas kotak sedang :
= p x l
= 0,2 x 0,2 = 0,04 mm2 jadi misalnya diperoleh:
Volume kotak sedang : 20 sel dalam satu kotak sedang
= 0,04 mm2 x 0,1 mm maka jumlah sel keseluruhan :
= 0,004 mm3 = 20 x (1/4) x 106
Karena 1 ml = 1cm2 = 5 x 106 sel/ml
Maka :
= 0,004 mm3
= 0,000004 cm3
= 4x10-6 ml
Sel/ml :
= jumlah sel/4x10-6 ml
= (jumlah sel/4) x 106
= jumlah sel x (¼) x 106
= jumlah sel x 2,5 x 105

Kotak sedang :
Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105
Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk
kotak kecil :
Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106

Cara kerja (digunakan kotak sedang) :

• Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue.
• Letakkan cover glass di atas alat hitung
• Tambahkan ± 50 μl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas.
• Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).
• Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.
• Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10.
• Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik). Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.

;